Proteinase K mNGS (likido)
Ang Proteinase K ay isang matatag na serine protease na may malawak na pagtitiyak ng substrate.Pinapababa nito ang maraming protina sa katutubong estado kahit na sa pagkakaroon ng mga detergent.Ang ebidensya mula sa mga pag-aaral ng kristal at molekular na istraktura ay nagpapahiwatig na ang enzyme ay kabilang sa subtilisin na pamilya na may aktibong site catalytic triad (Asp39-Kanya69-Ser224).Ang nangingibabaw na lugar ng cleavage ay ang peptide bond na katabi ng carboxyl group ng aliphatic at aromatic amino acids na may naka-block na alpha amino group.Ito ay karaniwang ginagamit para sa malawak na pagtitiyak nito.Ang proteinase K na ito ay espesyal na idinisenyo para sa mNGS.Kung ikukumpara sa iba pang proteinase K, naglalaman ito ng mas kaunting kontaminasyon ng nucleic acid na may parehong enzymatic na pagganap, na maaaring mas mahusay na matiyak ang downstream mNGS application.
Mga Kondisyon sa Imbakan
2-8 ℃ sa loob ng 2 taon
Pagtutukoy
| Hitsura | Walang kulay hanggang mapusyaw na kayumangging likido |
| Aktibidad | ≥800 U/ml |
| Konsentrasyon ng protina | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Walang natukoy |
| DNase | Walang natukoy |
| RNase | Walang natukoy |
Ari-arian
| Numero ng EC | 3.4.21.64(Recombinant mula sa Tritirachium album) |
| Isoelektrikong punto | 7.81 |
| Pinakamainam na pH | 7.0- 12.0 Larawan 1 |
| Pinakamainam na temperatura | 65 ℃ Larawan 2 |
| katatagan ng pH | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Thermal na katatagan | Mas mababa sa 50 ℃ (pH 8.0, 30 min) Fig. 4 |
| Katatagan ng imbakan | Higit sa 90% na aktibidad para sa 12 buwan sa 25 ℃ |
| Mga activator | SDS, urea |
| Inhibitor | Diisopropyl fluorophosphate;phenylmethylsulfonyl fluoride |
Mga aplikasyon
1. Genetic diagnostic kit
2. RNA at DNA extraction kit
3. Pagkuha ng mga sangkap na hindi protina mula sa mga tisyu, pagkasira ng mga dumi ng protina, tulad ng DNAmga bakuna at paghahanda ng heparin
4. Paghahanda ng chromosome DNA sa pamamagitan ng pulsed electrophoresis
5. Western blot
6. Enzymatic glycosylated albumin reagents sa vitro diagnosis
Mga pag-iingat
Magsuot ng mga guwantes at salaming de kolor kapag gumagamit o tumitimbang, at panatilihing maaliwalas ang hangin pagkatapos gamitin.Ang produktong ito ay maaaring maging sanhi ng reaksiyong alerdyi sa balat at malubhang pangangati sa mata.Kung malalanghap, maaari itong magdulot ng allergy o mga sintomas ng hika o dyspnea.Maaaring magdulot ng pangangati sa paghinga.
Depinisyon ng yunit
Ang isang yunit (U) ay tinukoy bilang ang dami ng enzyme na kinakailangan upang i-hydrolyze ang casein upang makagawa ng 1 μmoltyrosine kada minuto sa ilalim ng mga sumusunod na kondisyon.
Paghahanda ng mga reagents
I 100ml.
Reagent II: 0.1M trichloroacetic acid, 0.2M sodium acetate, 0.3M acetic acid.
Reagent III: 0.4M Na2CO3solusyon.
Reagent IV: Forint reagent na natunaw ng purong tubig nang 5 beses.
Reagent V: Enzyme diluent: 0.1M sodium phosphate solution (pH 8.0).
Reagent VI: tyrosine solution: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml tyrosine na natunaw sa 0.2M HCl.
Pamamaraan
1. Ang 0.5ml ng reagent I ay pre-warmed sa 37 ℃, magdagdag ng 0.5ml ng enzyme solution, haluing mabuti, at i-incubate sa37 ℃ sa loob ng 10 minuto.
2. Magdagdag ng 1ml ng reagent II upang matigil ang reaksyon, haluing mabuti, at ipagpatuloy ang pagpapapisa ng itlog sa loob ng 30mins.
3. Centrifugate reaction solution.
4. Kumuha ng 0.5ml supernatant, magdagdag ng 2.5ml reagent III, 0.5ml reagent IV, haluing mabuti at i-incubate sa 37 ℃sa loob ng 30mins.
5. OD660ay natukoy bilang OD1;blankong control group: 0.5ml reagent V ay ginagamit upang palitan ang enzymesolusyon upang matukoy ang OD660bilang OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tyrosine standard curve: 0.5mL different concentration L-tyrosine solution, 2.5mL Reagent III, 0.5mL Reagent IV sa 5mL centrifuge tube, incubate sa 37℃ sa loob ng 30mins, detect para sa OD660para sa iba't ibang konsentrasyon ng L-tyrosine, pagkatapos ay nakuha ang karaniwang curve Y=kX+b, kung saan ang Y ay ang L-tyrosine na konsentrasyon, X ay OD600.
Pagkalkula
2: Kabuuang dami ng solusyon sa reaksyon (mL)
0.5: Dami ng enzyme solution (mL)
0.5: Ang dami ng likidong reaksyon na ginagamit sa chromogenic determination (mL)
10: Oras ng reaksyon (min)
Df: Maramihang pagbabanto
C: Konsentrasyon ng enzyme (mg/mL)
Mga sanggunian
1. Wieger U at Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U at Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: Isang Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Mga figure
Fig.1 Pinakamainam pH
100mM buffer solution:pH6.0-8.0, Na-phosphate;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH.Concentration ng Enzyme:1mg/mL
Fig.2 Pinakamainam na temperatura
Reaksyon sa 20 mM K-phosphate buffer pH 8.0.Konsentrasyon ng enzyme: 1 mg/mL
Fig.3 pH Katatagan
25 ℃, 16 h-treatment na may 50 mM buffer solution: pH 4.5- 5.5, Acetate;pH 6.0-8.0, Na-phosphate;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0- 12.5, Glycine-NaOH.Konsentrasyon ng enzyme: 1 mg/mL
Fig.4 Thermal katatagan
30 min na paggamot na may 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0.Konsentrasyon ng enzyme: 1 mg/mL
Fig.5 Imbakan matatagty at 25 ℃
