RTL Reverse Transcriptase
Ang RTL reverse transcriptase ay isang RNA template-dependent DNA polymerase na kulang sa 3'→5' exonuclease na aktibidad at mayroong RNase H na aktibidad.Ang enzyme na ito ay maaaring gumamit ng RNA bilang isang template upang mag-synthesize ng isang komplementaryong strand ng DNA, na maaaring ilapat sa first-strand cDNA synthesis, lalo na para sa RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification).Kung ikukumpara sa RTL reverse transcriptase 1.0, ang sensitivity ay makabuluhang napabuti, ang thermal stability ay mas malakas, at ang reaksyon sa 65°C ay mas matatag.Maaaring gamitin ang RTL reverse transcriptase (glycerol free) para maghanda ng mga lyophilized na paghahanda, lyophilized RT-LAMP reagents atbp.
Kahulugan ng Yunit
Ang isang unit ay nagsasama ng 1 nmol ng dTTP sa acid-precipitable na materyal sa loob ng 20 minuto sa 50°C gamit ang poly(A)•oligo(dT)25 bilang template-primer.
Mga bahagi
| Component | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (Glycerol-free) (15U/μL) | 0.1 mL | 1 mL | 10 ML |
| 10×HC RTL Buffer | 1.5 ML | 4×1.5 mL | 5×10 mL |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 ML | 2×1.5 mL | 3×10 ML |
Kondisyon ng Imbakan
Transportasyon sa ilalim ng 0°C at maiimbak sa -25°C~-15°C.
Kontrol sa Kalidad
- Natirang Gawain ngEndonuclease:Ang isang 50 μL na reaksyon na naglalaman ng 1 μg ng λDNA at 15 unit ng RTL2.0 na incubated sa loob ng 16 na oras sa 37 ℃ ay nagpapakita ng parehong pattern tulad ng negatibong kontrol ng gel electrophoresis.
- Natirang Gawain ngExonuclease:Ang isang 50 μL na reaksyon na naglalaman ng 1 μg ng Hind Ⅲ digested λDNA at 15 unit ng RTL2.0 na incubated sa loob ng 16 na oras sa 37 ℃ ay nagpapakita ng parehong pattern tulad ng negatibong kontrol ng gel electrophoresis.
- Natirang Gawain ngNickase:Ang isang 50 μL na reaksyon na naglalaman ng 1 μg ng supercoiled pBR322 at 15 unit ng RTL2.0 na incubated sa loob ng 4 na oras sa 37°C ay nagpapakita ng parehong pattern tulad ng negatibong kontrol ng gel electrophoresis.
- Natirang Gawain ngRNase:Ang isang 10 μL na reaksyon na naglalaman ng 0.48 μg ng MS2 RNA at 15 mga yunit ng RTL2.0 na incubated para sa 4 na oras sa 37 ° C ay nagpapakita ng parehong pattern tulad ng negatibong kontrol ng gel electrophoresis.
- E. coli gDNA:Sinusukat gamit angE.colimga partikular na HCD detection kit，15 unit ng RTL2.0 ay naglalaman ng mas mababa sa 1E. coligenome.
Setup ng Reaksyon
cDNA Synthesis Protocol
| Mga bahagi | Dami |
| Template RNA a | opsyonal |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) o Random Primer mix(60uM) | 2 μL |
| dNTP Mix (10mM bawat isa) | 1 μL |
| RNase Inhibitor (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL Buffer | 2 μL |
| Tubig na walang nuclease | Hanggang sa 20 μL |
Mga Tala:
1) Ang inirerekomendang dosis ng Kabuuang RNA ay 1ng~1μg
2) Ang inirerekomendang dosis ng mRNA ay 50ng~100ng
Thermo-pagbibisikleta Mga kondisyon para sa isang gawain reaksyon：
| Temperatura (°C) | Oras |
| 25 °Ca | 5mins |
| 55 °C | 10minsb |
| 80 °C | 10mins |
Mga Tala:
1) Kung Random Primer Mix ang ginamit, isang incubation step sa 25°C.
2) Kung gagamitin ang target na primer mix, isang incubation step sa 55°C sa loob ng 10~30mins.
RT-LAMP Protocol
| Mga bahagi | Dami | Pangwakas na Konsentrasyon |
| Template RNA | opsyonal | ≥10 kopya |
| dNTP Mix (10mM) | 3.5 μL | 1.4 mM |
| FIP/BIP Primer (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 Primer (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB Primer (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase Inhibitor (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/Reaksyon |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/Reaksyon |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaksyon |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (Kabuuan 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (o 10×HC Bst V2 Buffer) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Tubig na walang nuclease | Hanggang sa 25 μL | - |
Mga Tala:
1) Paghaluin sa pamamagitan ng vortexing at centrifuge sandali upang mangolekta.Ang patuloy na pagpapapisa ng temperatura sa 65°C sa loob ng 1 oras.
2) Ang dalawang buffer ay interoperable at may parehong komposisyon.
Mga Tala
1. Ang produktong ito ay bubuo ng puting solid kapag nakaimbak sa -20 °C.Alisin ito mula sa -20°C at ilagay ito sa yelo nang mga 10 minuto.Pagkatapos matunaw, maaari itong gamitin sa pamamagitan ng pag-alog at paghahalo.
2. Ang produkto ng cDNA ay maaaring itago sa -20°C o -80°C o agad na gamitin para sa PCR reaction.
3. Upang maiwasan ang kontaminasyon ng RNase, mangyaring panatilihing malinis ang eksperimental na lugar, at magsuot ng malinis na guwantes at maskara sa panahon ng operasyon.
