5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Cat No: HCB5142A
Ang Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) ay isang napaka-stable na one-tube probe-based mix na angkop para sa one-step reverse transcription at quantitative PCR (qRT-PCR).Sinusuportahan nito ang pre-mixing ng mga primer at probe at mananatiling matatag pagkatapos ng mahabang panahon na imbakan sa mababang temperatura.Ang sample na susuriin ay maaaring direktang idagdag kapag ginagamit, nang walang karagdagang pagbubukas ng tubo/pagpapa-pipetting.Ang produktong ito ay nagbibigay ng mga bahagi, hal. hot-start DNA polymerase, M-MLV, heat-labile uracil DNA glycosylase (TS-UNG), RNase Inhibitor, MgCl2, mga dNTP (na may dUTP sa halip na dTTP), at mga stabilizer.Gamit ang genetically modified rapid amplification reverse transcriptase at DNA polymerase, posibleng makumpleto ang PCR amplification sa loob ng 20-40 minuto.Gumagamit ang reagent na ito ng espesyal na buffer para sa qPCR na may halo-halong enzyme ng anti-inhibitory amplification enzyme at UNG enzyme.Samakatuwid, maaari itong makakuha ng mahusay na amplification ng mga target na gene at maiwasan ang maling pagpapalakas na dulot ng PCR residual at aerosol pollution.Ang reagent na ito ay katugma sa karamihan ng fluorescence quantitative PCR instruments mula sa mga manufacturer gaya ng Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad at Roche.
Component
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Mga Kondisyon sa Imbakan
Ang lahat ng mga bahagi ay dapat panatilihin sa -20 ℃ para sa pangmatagalang imbakan at 4 ℃ para sa hanggang 3 buwan.Mangyaring paghaluin nang maigi pagkatapos ng lasaw at centrifuge bago gamitin.Iwasan ang madalas na freeze-thaw.
Paghahanda ng qRT-PCR Reaction System
| Mga bahagi | 25μLSistema | 50μLSistema | Pangwakas na Konsentrasyon |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5μL | 10μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1μL | 2μL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mixa | 1μL | 2μL | 1× |
| Template RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Hanggang sa 25μL | Hanggang sa 50μL | – |
1) a.Ang panghuling konsentrasyon ng panimulang aklat ay karaniwang 0.2μM.Para sa mas mahusay na mga resulta, ang konsentrasyon ng panimulang aklat ay maaaring i-optimize sa loob ng hanay na 0.2-1μM.Sa pangkalahatan, ang konsentrasyon ng probe ay maaaring i-optimize sa loob ng saklaw na 0.1-0.3μM.
2) b. Kapag gumagamit ng isang mabilis na Pamamaraan ng PCR, ang pagtaas ng konsentrasyon ng mga primer at probe ay maaaring magresulta sa mas mahusay na mga resulta ng amplification, at ang kanilang ratio ay dapat na ma-optimize nang naaayon.
3) Ang iba't ibang uri ng sample ay naglalaman ng iba't ibang uri at nilalaman ng inhibitor at numero ng kopya ng target na gene.Ang dami ng sample ay dapat isaalang-alang ayon sa aktwal na kondisyon.Gumawa ng dilution ng sample na may nuclease-free na tubig o TE Buffer, kung kinakailangan.
Reaksyon Cmga kondisyon
| Regular na Pamamaraan ng PCR | Mabilis na Pamamaraan ng PCR | ||||||
| Pamamaraan | Temp. | Oras | Ikot | Pamamaraan | Temp. | Oras | Ikot |
| Baliktad na Transkripsyon | 50 ℃ | 10-20mins | 1 | Baliktad na Transkripsyon | 50 ℃ | 5mins | 1 |
| Polymerase Pag-activate | 95 ℃ | 1-5mins | 1 | Polymerase Pag-activate | 95 ℃ | 30s | 1 |
| Denaturasyon | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 | Denaturasyon | 95 ℃ | 1-3s | 40-50 |
| Pagsusupil at Extension | 56-64 ℃ | 20-60s | Pagsusupil at Extension | 56-64 ℃ | 3-20s | ||
Kontrol sa Kalidad
1.Function detection: sensitivity, specificity at repeatability ng qPCR.
2.Walang exogenous nuclease activity: walang exogenous endonuclease at exonuclease pollution.
Mga Tala
1.Ang rate ng amplification ng mabilis na DNA polymerase ay hindi bababa sa 1kb/10s.Ang iba't ibang mga instrumento ng PCR ay may iba't ibang bilis ng pag-init at paglamig, mga mode ng pagkontrol ng temperatura at thermal conductivity, at sa gayon ay mahalaga ang pag-optimize ng iyong konsentrasyon ng primer/probe at paraan ng pagpapatakbo kasama ng iyong partikular na mabilis na instrumento ng PCR.
2.Ang produktong ito ay gumaganap ng malawak na kakayahang magamit, at ito ay angkop para sa high-sensitivity molecular diagnosis.Ang tatlong-hakbang na paraan ng PCR ay inirerekomenda para sa mga primer na may mababang temperatura ng pagsusubo o para sa pagpapalakas ng mahabang mga fragment na higit sa 200 bp.
3.Dahil ang iba't ibang mga amplicon ay may iba't ibang kahusayan sa paggamit ng dUTP at iba't ibang sensitivity sa UNG, ang mga reagents ay dapat na i-optimize kung ang sensitivity ng pagtuklas ay bumababa kapag gumagamit ng UNG system.Mangyaring makipag-ugnayan sa amin para sa teknikal na suporta kung kinakailangan.
4.Upang maiwasan ang paglaki ng mga produkto ng carryover na PCR, kinakailangan ang nakatuong pang-eksperimentong lugar at pipette para sa amplification.Magpatakbo gamit ang mga guwantes at magpalit ng madalas at huwag buksan ang PCR tube pagkatapos ng amplification.
