Magtanim ng direktang PCR Kit
Cat No: HCR2020A
Ang Plant Direct PCR Kit ay angkop para sa direktang pagpapalakas ng mga dahon ng halaman, buto, atbp., at maaaring gamitin para sa high-throughput na screening ng mga sample ng halaman na hindi naglalaman ng polysaccharides at polyphenols.Ang direktang amplification ng DNA polymerase batay sa nakadirekta na ebolusyon ay may higit na pagpapaubaya sa mga PCR inhibitors sa mga halaman.Samantala, pinapanatili nito ang mataas na pagganap ng amplification, na angkop para sa amplification ng mga fragment ng DNA sa loob ng 5 kb.Ang natatanging Lysis buffer A sa kit ay maaaring gamitin upang i-lyse ang sariwa o frozen na mga tisyu ng halaman.Ito ay madaling patakbuhin at ang lysate ay maaaring gamitin bilang isang template para sa amplification nang walang purification.Ang system ay naglalaman ng mga ahente ng proteksyon na nagbibigay-daan sa mga crude sample na epektibong palakasin pagkatapos ng paulit-ulit na pagyeyelo at lasaw.Ang 2 × Plant Direct Master Mix ay kailangan lang magdagdag ng mga primer at template upang maisagawa ang amplification reaction, sa gayon ay binabawasan ang mga pipetting operation at pagpapabuti ng detection throughput at reproducibility ng mga resulta.
Mga bahagi
| Mga bahagi | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Master Mix | 1.25 ml | 4×1.25 ml |
| Plant Direct Lysis Buffer A | 5 ml | 20 ml |
| Plant Direct Lysis Buffer B* | 5 ml | 20 ml |
*Ang Plant Direct Lysis Buffer B ay isang opsyonal na reagent, na ginagamit upang i-neutralize ang Plant Direct Lysis Buffer A para sa pagpapahaba ng oras ng pag-iimbak ng mga sample.Maaari itong gamitin ayon sa aktwal na sitwasyon.
Mga Kondisyon sa Imbakan
2 × Plant Direct Master Mix, mag-imbak sa -30 ~ -15℃ at iwasan ang paulit-ulit na pagyeyelo at lasaw;Plant Direct Lysis Buffer, mag-imbak sa -30 ~ -15℃ o 2 ~ 8℃.
Proseso ng Eksperimento
Pagproseso ng Sample–Dahon ng Halaman
Direktang paraan:Inirerekomenda na gumamit ng mga batang dahon.Gumamit ng hole punch na may fixed diameter na 0.5 – 3 mm para makakuha ng maliit at pare-parehong samplea, at pagkatapos ay direktang idagdag ang sample sa PCR system (50 μl system ang inirerekomenda).Tandaan, siguraduhin na ang sample ay nasa PCR solution at hindi laban sa tube wall.Kung ang direktang PCR ay ginagamit upang palakihin ang mahahabang fragment at kumplikadong mga sample, ang paggamit ng sample na may mas maliit na diameter (0.5 – 1 mm) bilang template ay makakatulong upang makakuha ng mas magagandang resulta.
Paraan ng paggiling ng lysis:Inirerekomenda na gumamit ng mga batang dahon.Kumuha ng isang maliit na piraso ng dahon (mga 1 – 3 mm ang lapad), ilagay ito sa 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, at durugin ito hangga't maaari (ang hakbang na ito ay maaaring gawin sa pamamagitan ng pagpiga sa dahon gamit ang 100 μl pipette tip para mash ang sample) .Kung ang mas malalaking volume ng leaf tissue ay ginagamit (hindi hihigit sa 7 mm), dagdagan ang volume ng dilution buffer sa 50 μl.Matapos ang mga dahon ay lupa, ang solusyon ay dapat lumitaw na berde.Pagkatapos ng maikling sentripugasyon, magdagdag ng 1 μl ng supernatant sa PCR system bilang template ng reaksyonc .
Paraan ng Thermal lysis:Inirerekomenda na gumamit ng mga batang dahon.Kumuha ng maliit na piraso ng dahon (mga 1 – 3 mm ang lapad), ilagay ito sa 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, at painitin ito sa 95°C sa loob ng 5 – 10 min.Ang oras ng lysis ay maaaring angkop na pahabain para sa mga dahon na mahirap i-lyse (hindi hihigit sa 20 min).Kung ang mas malalaking volume ng leaf tissue ay ginagamit (hindi hihigit sa 7 mm), dagdagan ang volume ng dilution buffer sa 50 μl.Pagkatapos ng pag-init, centrifuge sandali, at magdagdag ng 1 μl ng supernatant sa PCR system bilang template ng reaksyonb.
Pagproseso ng Sample– Binhi ng Halaman
Paraan ng paggiling ng lysis:Gumamit ng scalpel para putulin ang mga buto na may diameter na 5 mm, idagdag ang mga ito sa 100 μl ng Plant Direct Lysis Buffer A, at durugin ang sample gamit ang pipette tip o iba pang mga tool.Vortex sandali at hayaang tumayo sa temperatura ng kuwarto ng 3 – 5 min.Siguraduhing nakalubog ang sample ng binhi sa dilution buffer.Pagkatapos ng maikling sentripugasyon, magdagdag ng 1 μl ng supernatant sa PCR system bilang template ng reaksyon.
Paraan ng Thermal lysis:Gumamit ng scalpel para putulin ang mga buto na may diameter na 5 mm, idagdag ang mga ito sa 100 μl ng Plant Direct Lysis Buffer A, at init sa 95°C sa loob ng 5 – 10 min.Ang oras ng lysis ay maaaring angkop na pahabain para sa mga dahon na mahirap i-lyse (hindi hihigit sa 30 min).Pagkatapos ng pag-init, centrifuge sandali, at magdagdag ng 1 μl supernatant sa PCR system bilang template ng reaksyonb.
a.Ang mga gunting o iba pang mga tool ay maaari ding gamitin upang gupitin ang mga sample ng angkop na sukat;kung muling ginamit ang suntok o gunting, dapat itong linisin ng 2% sodium hypochlorite solution bago ang bawat paggamit upang maiwasan ang cross-contamination sa pagitan ng mga sample.
b.Siguraduhin na ang Plant Direct Lysis Buffer ay ganap na natunaw bago gamitin.Kung ang buffer ay malapot o may precipitates, maaari itong painitin sa 37 ℃ upang ganap itong matunaw bago gamitin.
c.Ang dami ng template sa sistema ng reaksyon ay maaaring iakma nang naaangkop ayon sa pagkakaiba sa dami ng materyal ng halaman at diluent na idinagdag.
Plant Direct Lysis Buffer
Ang Plant Direct Lysis Buffer A na nakapaloob sa produktong ito ay mahigpit na na-optimize upang mailabas ang genome ng karamihan sa mga tissue ng halaman at angkop para sa panandaliang pag-iimbak ng mga krudo na halaman sa 4 ℃.Kung ang sample ay kailangang itago sa mas mahabang panahon (hal., 1 – 2 buwan), inirerekumenda na ilipat ang supernatant sa isang bagong EP tube at itago ito sa -20 ℃.Para mas matatag na maimbak ang mga sample, magdagdag ng pantay na dami ng Plant Direct Lysis Buffer B sa inilipat na supernatant, haluing mabuti at itabi sa -20℃.Ang matatag na oras ng imbakan ay nag-iiba sa mga sample at estado ng halaman.
Sistema ng Reaksyon
| ddH2O | Hanggang 20.0 µl | Hanggang 50.0 µl |
| 2 × Plant Direct Master Mixa | 10.0 µl | 25.0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Sampol ng dahon ng halaman/crude extract(Sumangguni sa Sample Processing) | 0.5 – 3 mm leaf disc/x µl | 0.5 – 3 mm leaf disc/x µl |
a.Naglalaman ito ng Mg2+sa isang pangwakas na konsentrasyon ng 2 mM.
b.Inirerekomenda na gumamit ng panghuling konsentrasyon na 0.4μM para sa bawat panimulang aklat.Ang labis na paggamit ng mga panimulang aklat ay hahantong sa pagtaas ng hindi tiyak na amplification.
c.Ang dami ng sample na ginamit ay maaaring iakma ayon sa aktwal na sitwasyon.Ang halagang ginamit sa isang reaksyon ng crude lysed sample ay maaaring iakma sa pagitan ng 2% - 20% ng kabuuang dami ng reaksyon.Ang paggamit ng masyadong maraming sample ay maaaring magdulot ng pagkabigo sa amplification.
Programa ng Reaksyon
| Mga hakbang | Temperatura | Oras |
| Paunang Denaturasyon | 98 ℃ | 5 min |
| Denaturasyon | 95 ℃ | 10 seg |
| Pagsusupil | 58 ~ 72 ℃ | 15 seg |
| Extension | 72 ℃ | 30 seg |
| Pangwakas na Extension | 72 ℃ | 5 min |
a.Ang Initial Denaturation (98℃, 5 min) ay nagtataguyod ng lysis ng tissue ng halaman, na naglalabas ng genomic DNA na maaaring magamit para sa PCR amplification.Huwag paikliin ang oras o bawasan ang temperatura.
b.Inirerekomenda na itakda ito na katumbas ng halaga ng primer na Tm o 2 ~ 4 ℃ na mas mataas kaysa sa halaga ng Tm.Ang direktang amplification na DNA polymerase na ginamit sa produktong ito ay iba sa conventional Taq DNA polymerase, at may mga espesyal na kinakailangan para sa reaction annealing temperature; ang paggamit ng mataas na annealing temperature ay maaaring epektibong mabawasan ang nonspecific na amplification at mapabuti ang kahusayan ng amplification.Para sa mga kumplikadong template, ang mahusay na amplification ay maaaring makamit sa pamamagitan ng pagsasaayos ng temperatura ng pagsusubo at pagpapahaba ng oras ng extension.
c.Kung ang haba ng produkto ng amplification ay ≤1 kb, ang oras ng extension ay nakatakda sa 30 sec/kb;kung ang haba ng produkto ng amplification ay >1 kb, ang oras ng extension ay nakatakda sa 60 sec/kb.
d.Para sa mga kumplikadong sample o sample na may mababang ani ng amplification, ang bilang ng mga cycle ay maaaring naaangkop na tumaas sa 40 -50 na mga cycle.
Mga aplikasyon
Naaangkop ito para sa direktang pagpapalakas ng mga tissue ng halaman at high-throughput na screening ng mga sample ng halaman na hindi naglalaman ng polysaccharides at polyphenols.
Mga Tala
Para sa paggamit ng pananaliksik lamang.Hindi para gamitin sa mga diagnostic procedure.
1. Para sa crude plant amplification o direct amplification, inirerekumenda na gumamit ng purified genomic DNA bilang positibong kontrol bago simulan ang eksperimento upang matiyak na tama ang system, mga primer at operasyon.
2. Ang direktang amplification na DNA polymerase na ginamit sa kit na ito ay may malakas na aktibidad sa pag-proofread.Kung ang TA cloning ay kailangang isagawa, inirerekumenda na linisin ang DNA bago idagdag ang adenine.
3. Gabay sa Primer Design：
a.Inirerekomenda na ang huling base sa 3′ dulo ng primer ay dapat na G o C.
b.Dapat na iwasan ang magkakasunod na hindi pagkakatugma sa huling 8 base sa 3′ dulo ng primer.c.Iwasan ang mga istruktura ng hairpin sa 3′ dulo ng primer.
d.Ang mga pagkakaiba sa halaga ng Tm ng forward primer at ang reverse primer ay dapat na hindi hihigit sa 1 ℃ at ang halaga ng Tm ay dapat na iakma sa 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 ay inirerekomenda upang kalkulahin ang halaga ng Tm).
e.Ang mga karagdagang karagdagang sequence ng panimulang aklat na hindi tumutugma sa template, ay hindi dapat isama kapag kinakalkula ang halaga ng primer na Tm.
f.Inirerekomenda na ang GC na nilalaman ng panimulang aklat ay 40% -60%.
g.Ang pangkalahatang distribusyon ng A, G, C at T sa panimulang aklat ay dapat na pantay hangga't maaari.Iwasang gumamit ng mga rehiyong may mataas na nilalamang GC o AT.
h.Iwasan ang pagkakaroon ng mga pantulong na pagkakasunud-sunod ng 5 o higit pang mga base alinman sa loob ng panimulang aklat o sa pagitan ng dalawang panimulang aklat at iwasan ang pagkakaroon ng mga komplementaryong pagkakasunud-sunod ng 3 o higit pang mga base sa 3′ dulo ng dalawang panimulang aklat.
i.Gamitin ang function na NCBI BLAST para suriin ang specificity ng primer para maiwasan ang nonspecific na amplification.
