Rnase Inhibitor
Ang Murine RNase inhibitor ay isang recombinant murine RNase inhibitor na ipinahayag at nalinis mula sa E.coli.Ito ay nagbubuklod sa RNase A, B o C sa isang ratio na 1:1 sa pamamagitan ng non-covalent bonding, sa gayon ay pinipigilan ang aktibidad ng tatlong enzyme at pinoprotektahan ang RNA mula sa pagkasira.Gayunpaman, hindi ito epektibo laban sa RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H o RNase mula sa Aspergillus.Ang Murine RNase inhibitor ay sinubukan ng RT-PCR, RT-qPCR at IVT mRNA, at katugma sa iba't ibang komersyal na Reverse transcriptases, DNA polymerases at RNA polymerases.
Kung ikukumpara sa mga inhibitor ng RNase ng tao, ang murine RNase inhibitor ay hindi naglalaman ng dalawang cysteinees na lubos na sensitibo sa oksihenasyon na nagiging sanhi ng hindi aktibo ng inhibitor.Na ginagawa itong matatag sa mababang konsentrasyon ng DTT (mas mababa sa 1 mM).Ginagawa nitong angkop ang feature na ito para gamitin sa mga reaksyon kung saan ang mataas na konsentrasyon ng DTT ay masama sa reaksyon (hal. Real-time na RT-PCR).
Application
Ang produktong ito ay maaaring malawakang gamitin sa anumang eksperimento kung saan posible ang interference ng RNase upang maiwasan ang pagkasira ng RNA, gaya ng:
1.Synthesis ng unang strand ng cDNA, RT-PCR, RT-qPCR, atbp.
2.Pinoprotektahan ang RNA mula sa pagkasira sa panahon ng in vitro transcription/translation (hal., in vitro viral replication system).
3.Ang pagsugpo sa aktibidad ng RNase sa panahon ng paghihiwalay at paglilinis ng RNA.
Mga Kondisyon sa Imbakan
Ang produkto ay maaaring itago sa -25～- 15 ℃, may bisa sa loob ng 2 taon.
Buffer ng imbakan
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.6, 25 ℃), 8 mM DTT at 50% glycerol.
Depinisyon ng yunit
Ang halaga ng murine RNase inhibitor na kinakailangan upang pigilan ang aktibidad ng 5ng ng ribonuclease A ng 50% ay tinukoy bilang isang yunit (U).
Molekular na timbang ng protina
Ang molekular na timbang ng murine RNase inhibitor ay 50 kDa.
Kontrol sa kalidad
Exonuclease Aktibidad:
40 U ng murine RNase inhibitor na may 1 μg λ -Hind III digest DNA sa 37 ℃ sa loob ng 16 na oras ay hindi nagbubunga ng degradasyon gaya ng tinutukoy ng agarose gel electrophoresis.
Aktibidad ng Endonuclease:
Ang 40 U ng murine RNase inhibitor na may 1μ g λ DNA sa 37 ℃ sa loob ng 16 na oras ay hindi nagbubunga ng pagkasira tulad ng tinutukoy ng agarose gel electrophoresis.
Nicking Aktibidad:
Ang 40U ng murine RNase inhibitor na may 1μ g pBR322 sa 37 ℃ sa loob ng 16 na oras ay hindi nagbubunga ng pagkasira tulad ng tinutukoy ng agarose gel electrophoresis.
RNase Aktibidad:
Ang 40U ng murine RNase inhibitor na may 1.6μ g MS2 RNA sa loob ng 4h sa 37 ℃ ay hindi nagbubunga ng degradasyon tulad ng tinutukoy ng agarose gel electrophoresis.
E.coli DNA:
Ang 40 U ng murine RNase inhibitor ay na-screen para sa pagkakaroon ng E. coli genomic DNA gamit ang TaqMan qPCR na may mga primer na tiyak para sa E. coli 16S rRNA locus.Ang E. coli genomic DNA contamination ay ≤ 0.1 pg/40 U.
Notes
1. Ang marahas na oscillation o stirring ay hahantong sa hindi aktibo na enzyme.
2. Ang pinakamainam na hanay ng temperatura ng inhibitor na ito ay 25-55 ℃ , at ito ay hindi aktibo sa 65 ℃ pataas.
3. Ang mga aktibidad ng RNase H, RNase 1 at RNase T1 ay hindi hinarang ng murine RNase inhibitor.
4. Ang pagsugpo sa aktibidad ng RNase ay natagpuan sa isang malawak na hanay ng pH (pH 5-9 lahat ay aktibo), at ang pinakamataas na aktibidad ay naobserbahan sa pH 7-8.
5. Dahil ang mga ribonucleases ay kadalasang nagpapanatili ng aktibidad sa ilalim ng mga kondisyon ng pag-denaturing, kailangang mag-ingat upang maiwasan ang pag-denaturasyon ng mga molekula ng RNase Inhibitor na nakumplikado sa isang ribonuclease.Upang maiwasan ang paglabas ng aktibong ribonuclease, ang mga temperatura na higit sa 50 °C at mataas na konsentrasyon ng urea o iba pang mga ahente ng denaturing ay dapat na iwasan.
