Mini Kit ng Pagkuha ng DNA
Ang kit na ito ay gumagamit ng optimized na buffer system at silica gel column purification technology, na makakabawi ng 70 bp - 20 kb DNA fragment mula sa iba't ibang konsentrasyon ng TAE o TBE agarose gel.Ang column ng adsorption ng DNA ay maaaring espesyal na mag-adsorp ng DNA sa ilalim ng mataas na asin na kondisyon.Bilang karagdagan, maaaring direktang linisin ng kit ang mga fragment ng DNA mula sa mga produkto ng PCR, mga sistema ng reaksyon ng enzymatic o mga produktong krudo ng DNA na nakuha ng iba pang mga pamamaraan, at maaaring alisin ang mga impurities tulad ng mga protina, iba pang mga organic compound, inorganic na salt ions at oligonucleotide primers.Maaari nitong matiyak na ang paglilinis ay maaaring makumpleto sa loob ng 10-15min.Ang purified DNA ay maaaring gamitin nang direkta para sa ligation, transformation, enzyme digestion, in vitro transcription, PCR, sequencing, microinjection, atbp.
Mga kondisyon ng imbakan
Mag-imbak sa -15 ~ -25℃ at dalhin sa temperatura ng kuwarto.
Mga bahagi
| Mga bahagi | (100 rxns) |
| Buffer GDP | 80 ml |
| Buffer GW | 2 × 20 ml |
| Elution Buffer | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Buffer GDP:Buffer na nagbubuklod ng DNA.
Buffer GW:Paghuhugas ng buffer;magdagdag ng ganap na ethanol ayon sa ipinahiwatig na dami sa bote bago gamitin.
Elution Buffer:Elution.
FastPure DNA Mini Columns-G:Mga column ng DNA adsorption.
Mga Tubong Koleksyon 2 ml:Mga tubo ng koleksyon para sa pagsasala.
Mga Inihanda na Materyales
1.5 ml na isterilisadong tubo, absolute ethanol at isopropanol (kapag ang fragment ng DNA ay ≤100 bp, magdagdag ng 1 volume
isopropanol sa 1 dami ng gel), paliguan ng tubig.
Proseso ng Eksperimento
Magdagdag ng 80 ml ng ethanol upang palabnawin ang Buffer GW gaya ng ipinahiwatig sa tag bago gamitin, mag-imbak sa temperatura ng silid.
Mekanismo
1. Solusyon sa reaksyon ng PCR
Scheme ng pagkuha ng gel:Magdagdag ng pantay na volume Buffer GDP PCR reaction solution scheme ng pagbawi:Magdagdag ng 5 beses ang volume Buffer
2. GDP Kalkulahin ang dami ng gel(100 μl ay katumbas ng 100 mg)
I-dissolve ang gel
3. Painitin muna sa 50 ~ 55℃
4. Bind Wash
Magdagdag ng 300 μL ng Buffer GDP*
Magdagdag ng 700 μL ng Buffer GW
Magdagdag ng 700 μL ng Buffer GW
5. Elute
Magdagdag ng 20 – 30μL ng Elution Buffer o deionized na tubig
Mga Tala* Pagbawi ng likido sa reaksyon ng PCR nang walang hakbang na ito
Programa ng pagkuha ng gel
1. Pagkatapos ng DNA electrophoresis para sa fractionating DNA fragment, excise ang solong stripe ng DNA fragment mula sa agarose gel sa ilalim ng UV light.Inirerekomenda na gumamit ng sumisipsip na papel upang sumipsip ng maliwanag na kahalumigmigan ng gel at mabawasan ang laki ng hiwa ng gel sa pamamagitan ng pag-alis ng sobrang agarose hangga't maaari hangga't maaari.Timbangin ang hiwa ng gel (nang walang microcentrifuge tube) para kalkulahin ang volume nito: Ang volume ng 100 mg gelslice ay humigit-kumulang 100 μL, kung ipagpalagay na ang density ay 1g/ml.
2. Magdagdag ng pantay na dami ng Buffer GDP, i-incubate sa 50~55 ℃ para sa 7-10 min (ayon sa laki ng gel, ayusin ang oras ng incubation hanggang sa ganap na matunaw ang gel).Baliktarin ang tubo ng 2 beses sa panahon ng pagpapapisa ng itlog.
Δ Ang pagdaragdag ng 1-3 volume ng Buffer GDP ay hindi makakaimpluwensya sa kahusayan sa pagbawi ng DNA.Kung ang DNA fragment na mababawi <100 bp, 3 volume ng Buffer GDP ang kailangang idagdag;kapag ang hiwa ng gel ay ganap na natunaw, magdagdag ng 1 dami ng isopropanol at ihalo nang lubusan, pagkatapos ay magpatuloy sa susunod na hakbang.
3. I-centrifuge saglit upang dalhin ang sample sa ilalim ng tubo, ipasok ang FastPure DNA Mini Columns-G sa Collection Tubes 2 ml, maingat na ilipat ang solusyon nang maximum na 700 μL isang beses sa isang
oras sa mga column ng pagsasala, centrifuge sa 12,000 rpm (13,800 X g) sa loob ng 30-60 seg.
4. Itapon ang filtrate at magdagdag ng 300 μL ng Buffer GDP sa column, i-incubate sa room temperature para sa 1 min, centrifuge sa 12,000 rpm (13,800 X g) para sa 30-60 sec.
5. Itapon ang filtrate at magdagdag ng 700 μL ng Buffer GW (suriin kung naidagdag nang maaga ang absolute ethanol!) sa column, centrifuge sa 12,000 rpm (13,800 X g) sa loob ng 30-60 seg.
Δ Mangyaring magdagdag ng Buffer GW sa paligid ng adsorption column wall, o magdagdag ng Buffer GW na takip sa likod at paghaluin ito nang baligtad nang 2 – 3 beses upang makatulong na ganap na ma-flush ang asin na nakadikit sa tube wall.
6. Ulitin ang hakbang 5.
Δ Ang pag-flush gamit ang Buffer GW ng dalawang beses ay maaaring matiyak na ang asin ay ganap na maalis at maalis ang epekto sa mga kasunod na eksperimento.
7. Itapon ang filtrate at i-centrifuge ang bakanteng column sa 12,000 rpm (13,800 X g) sa loob ng 2 min.
8. Ipasok ang column sa isang malinis na 1.5 ml microcentrifuge tube, magdagdag ng 20 - 30 μL ng Elution Buffer sa gitna ng column membrane, i-incubate ng 2 min, at pagkatapos ay centrifuge sa 12,000 rpm (13,800 X g) para sa1 min.Itapon ang column, itabi ang nakuhang DNA sa -20 .
Δ Ang paglipat ng supernatant ng hakbang 8 sa column upang muling i-elute at painitin ang Elution Buffer sa 55 (kapag ang DNA fragment >3 kb) ay maaaring makatulong upang mapataas ang kahusayan sa pagbawi.
Programa sa pagbawi ng mga produkto ng PCR
Naaangkop ang protocol na ito upang linisin ang mga fragment ng DNA mula sa mga produkto ng PCR, enzymatic reaction system at iba pang produkto ng krudo ng DNA (kabilang ang genetic DNA).Ang solusyon na ito ay mahusay na makakapag-alis ng iba't ibang mga nucleotide, primer, primer dimer, salt molecules, enzymes at iba pang impurities.
1. Saglit na i-centrifuge ang mga produkto ng PCR, enzymatic reaction solution, at iba pang produkto ng krudo ng DNA.Tantyahin ang kanilang dami gamit ang pipette at ilipat sa isang isterilisadong 1.5 ml o 2 ml na tubo.Magdagdag ng ddH2O hanggang sa dami ng hanggang 100 μL;habang para sa genomic DNA na may mataas na konsentrasyon, ang pagtunaw sa 300 μL na may ddH2O ay makakatulong upang mapabuti ang kahusayan sa pagbawi.
2. Magdagdag ng 5 volume ng Buffer GDP, ihalo nang maigi sa pamamagitan ng pagbaligtad o pag-vortex.Kung DNA fragment of interest >100 bp, kailangang magdagdag ng karagdagang 1.5 volume (mga sample + Buffer GDP) ng ethanol.
3. Ipasok ang column pabalik sa collection tube, ilipat ang mixtrue sa column, centrifuge sa 12,000 rpm (13,800 ×g) sa loob ng 30 – 60 sec.Kung ang dami ng pinaghalong solusyon ay >700 µL, ibalik ang adsorption column sa collection tube, ilipat ang natitirang solusyon sa adsorption column, at centrifuge sa 12,000 rpm (13,800 × g) sa loob ng 30 – 60 sec.
4. Ang susunod na pagganap ay tumutukoy sa hakbang 5 – 8 ng 08- 1/Gel extraction program.
Mga aplikasyon
Iba't ibang konsentrasyon ng TAE o TBE agarose gel;Mga produkto ng PCR, mga sistema ng reaksyong enzymatic o iba pang produktong krudo ng DNA na nakuha sa iba't ibang pamamaraan.Ang mga na-recover na fragment ay mula sa70 bp -20 kb.
Mga Tala
Para sa paggamit ng pananaliksik lamang.Hindi para gamitin sa mga diagnostic procedure.
1. Magdagdag ng 80 ml ng ethanol upang palabnawin ang Buffer GW gaya ng ipinahiwatig sa tag bago gamitin, itabi sa temperatura ng silid.
2. Kung ang Buffer GDP ay madaling ma-precipitate sa panahon ng mababang temperatura na imbakan, maaari itong ilagay sa temperatura ng silid sa loob ng isang panahon bago gamitin.Kung kinakailangan, maaari itong painitin sa isang 37 ℃ na paliguan ng tubig hanggang ang namuo ay ganap na matunaw, at pagkatapos ay maaari itong gamitin pagkatapos ng paghahalo.
3. Itakda ang temperatura ng paliguan ng tubig sa 50 ~55 ℃ nang maaga.
4. Sa 08-1/Gel extraction program step 1, ang pagliit sa laki ng gel slice ay makabuluhang bawasan ang oras ng pagkatunaw at tataas ang kahusayan sa pagbawi (Ang Linearized DNA ay madaling mag-hydrolyze kapag patuloy na nakalantad sa mataas na temperatura).Huwag ilantad ang DNA gel sa UV sa mahabang panahon, dahil ang ultraviolet light ay maaaring magdulot ng pinsala sa DNA.
5. I-dissolve ang gel sa 08- 1/Gel extraction program step 2 nang lubusan, kung hindi, ang kahusayan sa pagbawi ng DNA ay malubhang maaapektuhan.
6. Painitin ang Elution Buffer o ddH2O sa 55 ℃ , na nakakatulong upang mapabuti ang kahusayan sa pag-elusyon ng DNA.Inirerekomenda na mag-imbak ng DNA sa eluent na 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 – 8.5.
