EndoFree Plasmid Maxi Kit
Ang kit na ito ay angkop para sa pagkuha mula sa 150 – 300 ml ng bacterial solution na nilinang magdamag, gamit ang isang pinahusay na SDS-alkaline lysis na paraan upang i-lyse ang bacteria.Ang crude extract ay piling pinagsama sa isang natatanging Endotoxin Scavenger at pinaghihiwalay ng centrifugation upang alisin ang mga endotoxin.Pagkatapos, ang silica gel membrane ay piling nagbubuklod sa plasmid DNA sa solusyon sa ilalim ng mga kondisyon ng mataas na asin at mababang pH.Sinusundan ito ng pagdaragdag ng wash buffer para alisin ang mga dumi at iba pang bacterial component.Sa wakas, ang isang low-salt, high-pH elution buffer ay ginagamit upang i-elute ang purong plasmid DNA mula sa silicon matrix membrane.Ang silica gel membrane ay gumagamit ng espesyal na adsorption membrane, at ang pagkakaiba ng halaga ng adsorption sa pagitan ng column at column ay napakaliit at ang repeatability ay mabuti.Ang phenol, chloroform at iba pang nakakalason na reagents ay hindi kinakailangan, at hindi rin ang mga hakbang sa pag-ulan ng ethanol.Maaaring gamitin ang kit na ito upang mabilis na kunin ang 0.2 -1.5 mg ng purong high-copy na plasmid DNA, na may rate ng pagkuha na 80% -90%.Gumagamit ang kit ng kakaibang pormula ng proseso na nagtatanggal ng endotoxin, napakababa ng nilalaman ng endotoxin at napakahusay ng epekto ng paglipat ng cell.Ang na-extract na plasmid ay maaaring direktang magamit sa enzyme digestion, PCR, in vitro transcription, transformation, sequencing at iba pang mga eksperimento sa molecular biology.
Mga kondisyon ng imbakan
Ang RNaseA ay dapat na nakaimbak sa -30 ~ -15 ℃ at dinadala sa ≤0 ℃ .
Maaaring maimbak ang Endotoxin Scavenger sa 2 ~ 8 ℃ sa loob ng isang buwan, na nakaimbak sa -30 ~ -15 ℃ para sa pangmatagalang imbakanat dinadala sa ≤0 ℃ .
Ang iba pang mga bahagi ay dapat na naka-imbak sa temperatura ng silid (15 ~ 25 ℃) at dinadala sa temperatura ng silid.
Mga bahagi
| Mga bahagi | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Buffer P1 | 75 ml |
| Buffer P2 | 75 ml |
| Buffer P4 | 75 ml |
| Endotoxin Scavenger | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Buffer TB | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi Column ( Bawat isa sa isang 50ml Collection Tube) | 10 |
| Endotoxin-free Collection Tube | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, ginagamit para alisin ang RNA.
Buffer P1:bacterial suspension buffer, idagdag ang RNaseA sa Buffer P1 bago ang unang paggamit.
Buffer P2:bacterial lysis buffer (naglalaman ng SDS/NaOH).
Buffer P4:neutralizing buffer.
Endotoxin Scavenger:mabisang alisin ang endotoxin mula sa crude plasmid extract.
Buffer PW:maghugas ng buffer, idagdag ang itinakdang dami ng ethanol bago unang gamitin.
Buffer TB:elution buffer.
FastPure DNA Maxi Column:mga column ng adsorption ng plasmid DNA.
Mga Tubong Koleksyon 50 ml:filtrate collection tubes.
Endotoxin-free Collection Tube:mga tubo ng koleksyon ng plasmid DNA.
Mga Inihanda na Materyales
Absolute ethanol, isopropanol, 50 ml round-bottom centrifuge tubes at 50 ml endotoxin-freemga tubo ng centrifuge.
Mga aplikasyon
Ang produktong ito ay angkop para sa malakihang pagkuha ng mga plasmid mula sa 150 - 300 ml ng bacterial solutionnilinang magdamag.
Proseso ng Eksperimento
1. Uminom ng 150 – 200 ml (hindi hihigit sa 300 ml) ng bacterial solution na nilinang magdamag at i-centrifuge sahumigit-kumulang 11,000 rpm (12,000 × g) sa loob ng 1 – 2 min.Itapon ang supernatant at mangolekta ng bacteria.
Δ Kapag nangongolekta ng higit sa 50 ml ng bacterial solution, ang bacteria ay maaaring kolektahin sa pamamagitan ng pagdaragdag ng bacterial solution, centrifugation, pagtatapon ng supernatant at iba pang hakbang sa parehong 50 ml tube para sa
maraming beses.
2. Magdagdag ng 7.5 ml ng Buffer P1 (pakisuri kung ang RNaseA ay naidagdag sa Buffer P1) sa centrifugetube na naglalaman ng bacteria at ihalo nang maigi sa pamamagitan ng vortex o pipetting.
Δ Ang kumpletong resuspension ng bacteria sa hakbang na ito ay kritikal na magbunga, at dapat walang bacterial clump pagkatapos ng resuspension.Kung may mga bacterial clumps na hindi lubusang pinaghalo, makakaapekto ito sa lysis, na magreresulta sa mababang ani at kadalisayan.Kung ang OD600 ng bacterial solution ay 0.65, inirerekomenda na 7.5 ml ng Buffer P1 ang gamitin kapag kumukuha mula sa 150 ml ng bacterial solution;kapag ang OD600 ay 0.75, 8 ml ng Buffer P1 ang dapat gamitin at ang mga volume ng Buffers P2 at P4 ay dapat baguhin nang naaayon.Kung ang dami ng bacterial solution ay tumaas sa 200 ml, inirerekomenda na angdami ng Buffer na P1, P2, at P4 ay tataas nang proporsyonal.
3. Magdagdag ng 7.5 ml ng Buffer P2 sa bacterial suspension mula sa hakbang 2 at ihalo nang malumanay pataas at pababa para sa 6 – 8beses at incubate sa temperatura ng kuwarto para sa 4 - 5 min.
Δ Baligtarin nang malumanay upang maihalo nang maigi.Ang pag-vortex ay magdudulot ng genomic DNA fragmentation, na magreresulta sa genomic DNA fragment sa nakuhang plasmid.Sa oras na ito, ang solusyon ay nagiging malapot at translucent, na nagpapakita na ang bakterya ay ganap na na-lysed.Ang tagal ay hindi dapat lumampas sa 5 min upang maiwasan ang pagkasira ng mga plasmid.Kung ang solusyon ay hindi malinaw, maaaring mayroong masyadong maraming bacteria na nagreresultahindi kumpletong lysis, kaya ang dami ng bakterya ay dapat na bawasan nang naaangkop.
4. Magdagdag ng 7.5 ml ng Buffer P4 sa bacterial suspension mula sa hakbang 3 at agad na baligtarin nang malumanay 6 – 8 beses upang payagan ang solusyon na ganap na ma-neutralize ang Buffer P2.Sa oras na ito, dapat lumitaw ang puting flocculent precipitate.Centrifuge sa higit sa 11,000 rpm (12,000 × g) sa loob ng 10 – 15 min, maingat na i-pippet ang supernatant sa isang bagong 50 ml round-bottom centrifuge tube (self-prepared), at iwasanaspirate ang lumulutang na puting namuo.
Δ Magdagdag ng Buffer P4 at agad na baligtarin upang ihalo nang mabuti.Iwanan ang tubo na tumayo hanggang ang puting namuo ay ibinahagi nang pantay-pantay sa buong solusyon upang maiwasan ang paggawa ng lokal na pag-ulan na maaaring makaapekto sa neutralisasyon.Kung walang pare-parehong puting flocculent precipitate bago centrifugation at ang supernatant ay hindi malinaw pagkatapos centrifugation, ang tubo ay maaaringcentrifuged para sa isa pang 5 min.
5. Magdagdag ng 0. 1 beses ang volume (10% ng supernatant volume, humigit-kumulang 2.2 ml) ng Endotoxin Scavenger sa supernatant mula sa hakbang 4 at baligtarin upang ihalo.Ilagay ang solusyon sa isang ice bath o ipasok sa dinurog na yelo (o refrigerator freezer) sa loob ng 5 minuto hanggang ang solusyon ay magbago mula sa malabo hanggang sa malinaw at transparent (o pa rinbahagyang malabo), at paminsan-minsan ay ihalo nang maraming beses.
Δ Pagkatapos idagdag ang Endotoxin Scavenger sa supernatant, ang supernatant ay magiging maputik ngunit angAng supernatant ay dapat maging malinaw (o bahagyang maputik) pagkatapos lumamig sa ice bath.
6. Pagkatapos mailagay ang supernatant sa temperatura ng silid (>25 ℃) sa loob ng 10 – 15 min, ito ay magiging maputik bilangtumataas ang temperatura nito sa temperatura ng silid.Pagkatapos ang supernatant ay dapat baligtarin upang maghalo.
Δ Kung ang temperatura ng silid ay mas mababa o gusto mong bawasan ang oras ng pagkuha, ang supernatant ay maaaring i-incubate sa isang 37 ~ 42 ℃ na paliguan ng tubig sa loob ng 5 - 10 min at ang susunod na hakbang ay maaaring isagawa pagkatapos ng supernatantnagiging malabo.
7. I-centrifuge ang supernatant sa humigit-kumulang 11,000 rpm (12,000 × g) sa loob ng 10 min sa temperatura ng silid (ang temperatura ay dapat na >25 ℃) upang paghiwalayin ang bahagi.Ang upper aqueous phase ay naglalaman ng DNA habang ang lower blue oily phase layer ay naglalaman ng endotoxin at iba pang impurities.Ilipat angDNA-containing aqueous phase sa isang bagong tubo atitapon ang oily layer.
Δ Ang temperatura sa panahon ng centrifugation ay dapat na higit sa 25 ℃ bilang epektibong phase separation ay hindimangyari kung ang temperatura ay masyadong mababa.
Δ Kung ang phase separation ay hindi epektibo, ang centrifugation temperature ay maaaring iakma sa 30 ℃ atang oras ng centrifugation ay maaaring tumaas sa 15 min.
Δ Huwag sipsipin ang asul na oily layer dahil naglalaman ito ng endotoxin at iba pang mga dumi.
Mekanismo
Neutralisasyon ng Resuspension Lysis
◇ Magdagdag ng 7.5 ml Buffer P1
◇ Magdagdag ng 7.5 ml Buffer P2
◇ Magdagdag ng 7.5 ml Buffer P4
Pag-alis ng endotoxin
◇ Magdagdag ng 0. 1 beses ang dami ng supernatant ng Endotoxin Scavenger
Pagbubuklod at Paglalaba
◇ Magdagdag ng 0.5 beses ng dami ng isopropanol
◇ Magdagdag ng 10 ml Buffer PW
◇ Magdagdag ng 10 ml Buffer PW
Elution
◇ Magdagdag ng 1 – 2 ml Buffer TB o Endotoxin-free ddH2O
