Uracil DNA Glycosylase
Ang Uracil-DNA Glycosylase (UNG o UDG) ay isang recombinant clone ng E.coli na may molecular weight na 25 kDa.Pinapaandar nito ang pagpapakawala ng libreng uracil mula sa uracil na naglalaman ng single-stranded at double-stranded na DNA, at hindi aktibo laban sa RNA, at maaaring magamit upang maiwasan ang kontaminasyon ng mga produkto ng PCR amplification.Ang prinsipyo ng pagkilos ay batay sa katotohanan na kung ang dUTP ay pinalitan ng dTTP sa reaksyon ng PCR at isang produkto ng PCR amplification na naglalaman ng mga base ng dU ay nabuo, ang enzyme ay maaaring piliing masira ang glycosidic bond ng mga U base sa single-stranded at double-stranded. DNA at i-degrade ang produkto ng PCR amplification.
Inirerekomendang Aplikasyon
Pagpapalakas ng Pag-iwas sa Kontaminasyon
Kondisyon ng Imbakan
-20°C para sa pangmatagalang imbakan, dapat ihalo nang mabuti bago gamitin, iwasan ang madalas na freeze-thaw.
Buffer ng imbakan
20 mM Tris-HCl (pH 8.0) , 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilizer, 50% Glycerol.
Kahulugan ng Yunit
Ang dami ng enzyme na kinakailangan para i-degrade ang 1µg ng single-stranded DNA na naglalaman ng mga dU base sa 1 oras sa 37°C ay 1 unit.
Kontrol sa Kalidad
1.SDS-PAGE electrophoretic purity na higit sa 98%
2.Pagkasensitibo ng amplification, kontrol ng batch-to-batch, katatagan
3.Matapos ang 1U ng UNG ay tratuhin sa 50 ℃ sa loob ng 2 minuto, ang template na naglalaman ng U na mas mababa sa 103 na kopya ay dapat na ganap na masira at walang produkto ng amplification ang maaaring gawin
4.Walang exogenous na aktibidad ng nuclease
Mga tagubilin
| Mga bahagi | Dami (μL) | Panghuling konsentrasyon |
| 10 × PCR Buffer (walang dNTP, Mg²+libre) | 5 | 1× |
| mga dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (palitan ang dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0.25 U (0.1-0.5) |
| 25 × Primer Mixa | 2 | 1× |
| Template | - | ＜1μg/reaksyon |
| ddH₂O | Hanggang 50 | - |
Tandaan: a: Kung ginamit para sa qPCR/qRT-PCR, dapat idagdag ang fluorescent probe sa reaction system.Karaniwan, ang pangwakas na konsentrasyon ng primer na 0.2 μM ay maaaring magbigay ng magagandang resulta;kapag ang pagganap ng reaksyon ay mahina, ang konsentrasyon ng panimulang aklat ay maaaring iakma sa hanay na 0.2-1 μM.Karaniwan, ang konsentrasyon ng probe ay na-optimize sa hanay na 0.1-0.3 μM.Maaaring isagawa ang mga eksperimento sa gradient ng konsentrasyon upang mahanap ang pinakamahusay na kumbinasyon ng panimulang aklat at probe.
Mga Tala
1.Maaaring gamitin ang UNG enzyme upang alisin ang mga kontaminadong produkto ng amplification ng dUTP mula sa sistema ng reaksyon bago ang reaksyon ng PCR amplification, pagkatapos ay upang maiwasan ang mga maling positibong resulta dahil sa kontaminasyon ng produkto.
2.Ang pinakamainam na temperatura para sa UNG enzyme na gagamitin sa anti-contamination PCR reaction ay karaniwang 50 ℃ para sa 2mins;ang inactivation condition ay 95 ℃ sa loob ng 5mins.
3.Iwasan ang madalas na freeze-thaw, at huwag ilantad sa malalaking pagbabago sa temperatura.
4.Ang iba't ibang mga gene na ipapalaki ay may iba't ibang kahusayan sa paggamit ng dUTP at sensitivity sa UNG enzyme, samakatuwid, kung ang paggamit ng UNG system ay humahantong sa pagbaba ng sensitivity ng pagtuklas, ang sistema ng reaksyon ay dapat ayusin at i-optimize, kung kailangan mo ng teknikal na suporta, mangyaring makipag-ugnay aming kompanya.
