Proteinase K NGS (pulbos)
Cat No: HC4507A
Ang NGS Protease K ay isang stable na serine protease na may mataas na aktibidad ng enzyme at malawak na substrate specificity. Mas gusto ng enzyme na nabubulok ang mga ester bond at peptide bond na katabi ng C-terminal ng hydrophobic amino acids, sulfur-containing amino acids at aromatic amino acids.Kaya, ito ay madalas na ginagamit upang pababain ang mga protina sa maikling peptides.Ang NGS Protease K ay isang tipikal na serine protease na may Asp39-Kanya69-Ser224catalytic triad na kakaiba sa serine protease, at ang catalytic center ay napapalibutan ng tow Ca2+nagbubuklod na mga site para sa pagpapapanatag, pagpapanatili ng mataas na aktibidad ng enzyme sa ilalim ng mas malawak na hanay ng mga kondisyon.
Pagtutukoy
| Hitsura | Puti hanggang puti na amorphous powder, lyophilized |
| Partikular na aktibidad | ≥40U/mg solid |
| DNase | Walang natukoy |
| RNase | Walang natukoy |
| Bioburden | ≤50CFU/g solid |
| Nalalabi sa nucleic acid | <5pg/mg solid |
Ari-arian
| Pinagmulan | Tritirachium album |
| Numero ng EC | 3.4.21.64(Recombinant mula sa Tritirachium album) |
| Molekular na timbang | 29kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektrikong punto | 7.81 Fig.1 |
| Pinakamainam na pH | 7.0-12.0 (Lahat ay gumaganap ng mataas na aktibidad) Fig.2 |
| Pinakamainam na temperatura | 65 ℃ Fig.3 |
| Katatagan ng pH | pH 4.5-12.5 (25℃,16h) Fig.4 |
| Thermal na katatagan | Mas mababa sa 50 ℃ (pH 8.0, 30min) Fig.5 |
| Katatagan ng imbakan | Naka-imbak sa 25 ℃ para sa 12 buwan Fig.6 |
| Mga activator | SDS, urea |
| Inhibitor | Diisopropyl fluorophosphate;benzylsulfonyl fluoride |
Mga Kondisyon sa Imbakan
Itago ang lyophilized powder sa -25~-15 ℃ sa mahabang panahon malayo sa liwanag;Pagkatapos ng dissolution, aliquot sa naaangkop na volume para sa panandaliang imbakan sa 2-8 ℃ ang layo mula sa liwanag o pangmatagalang imbakan sa -25~-15 ℃ ang layo mula sa liwanag.
Mga pag-iingat
Magsuot ng mga guwantes at salaming de kolor kapag gumagamit o tumitimbang, at panatilihing maaliwalas ang hangin pagkatapos gamitin.Ang produktong ito ay maaaring maging sanhi ng reaksiyong alerdyi sa balat at malubhang pangangati sa mata.Kung malalanghap, maaari itong magdulot ng allergy o mga sintomas ng hika o dyspnea.Maaaring magdulot ng pangangati sa paghinga.
Depinisyon ng yunit
Ang isang yunit ng NGS Protease K ay tinukoy bilang ang dami ng enzyme na kinakailangan upang i-hydrolyze ang casein sa 1 μmol L-tyrosine sa ilalim ng karaniwang mga kondisyon ng pagpapasiya.
Paghahanda ng mga reagents
| Reagent | Manufacturer | Catalog |
| Teknikal si Caseinmula sa gatas ng baka | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Trichloroacetic acid | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Sodium acetate | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Acetic acid | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Sodium carbonate | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Foline-phenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tyrosine | Sigma | 93829 |
Reagent I:
Substrate: 1% Casein mula sa bovine milk solution: i-dissolve ang 1g bovine milk casein sa 50ml ng 0.1M sodium phosphate solution, pH 8.0, init sa water bath sa 65-70 °C sa loob ng 15mins, haluin at matunaw, palamig sa tubig, inayos ng sodium hydroxide sa pH 8.0, at ihalo sa 100ml.
Reagent II:
TCA solution: 0.1M trichloroacetic acid, 0.2M sodium acetate at 0.3M acetic acid (timbangin ang 1.64g trichloroacetic acid + 1.64g sodium acetate + 1.724mL acetic acid nang sunud-sunod, magdagdag ng 50mL deionized na tubig, i-adjust sa 4.HCl at 4.HCl 100ml).
Reagent III:
0.4m sodium carbonate solution (timbangin ang 4.24g anhydrous sodium carbonate at matunaw sa 100mL na tubig)
Reagent IV:
Folin phenol reagent: dilute ng 5 beses na may deionized na tubig.
Reagent V:
Enzyme diluent: 0.1 M sodium phosphate solution, pH 8.0.
Reagent VI:
L-tyrosine standard solution:0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml L-tyrosine na natunaw sa 0.2M HCl.
Pamamaraan
1. I-on ang UV-Vis spectrophotometer at piliin ang photometric measurement.
2. Itakda ang wavelength bilang 660nm.
3. I-on ang water bath, itakda ang temperatura sa 37 ℃, tiyaking hindi nagbabago ang temperatura sa loob ng 3-5mins.
4. Painitin muna ang 0.5mL substrate sa isang 2mL centrifuge tube sa 37℃ water bath sa loob ng 10mins.
5. I-extract ang 0.5mL na diluted enzyme solution sa preheated centrifuge tube sa loob ng 10 minuto.Itakda ang enzyme diluent bilang blangko na grupo.
6. Magdagdag ng 1.0 mL TCA reagent kaagad pagkatapos ng reaksyon.Haluing mabuti at i-incubate sa water bath sa loob ng 30 minuto.
7. Centrifugate reaction solution.
8. Idagdag ang mga sumusunod na bahagi sa pagkakasunod-sunod na tinukoy.
| Reagent | Dami |
| Supernatant | 0.5 ML |
| 0.4M Sodium carbonate | 2.5 ML |
| Folin phenol reagent | 0.5 ML |
9. Haluing mabuti bago i-incubate sa water bath sa 37 ℃ sa loob ng 30 min.
10. OD660ay natukoy bilang OD1;blank control group: Ang enzyme diluent ay ginagamit upang palitan ang enzyme solution upang matukoy ang OD660bilang OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. L-tyrosine standard curve: 0.5mL different concentration L-tyrosine solution, 2.5mL 0.4M Sodium carbonate, 0.5mL Folin phenol reagent sa 5mL centrifuge tube, incubate sa 37℃ sa loob ng 30mins, detect para sa OD660para sa iba't ibang konsentrasyon ng L-tyrosine, pagkatapos ay nakuha ang karaniwang curve Y=kX+b, kung saan ang Y ay ang L-tyrosine na konsentrasyon, X ay OD600.
Pagkalkula
2: Kabuuang dami ng solusyon sa reaksyon (mL)
0.5: Dami ng enzyme solution (mL)
0.5: Ang dami ng likidong reaksyon na ginagamit sa chromogenic determination (mL)
10: Oras ng reaksyon (min)
Df: Maramihang pagbabanto
C: Konsentrasyon ng enzyme (mg/mL)
Mga figure
Fig.1 DNA residue
| Sample | Ave C4 | Nucleic Acid Pagbawi(pg/mg) | Pagbawi(%) | Kabuuang Nucleic Acid ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNA-Free H2O | Hindi tiyak | — | — | — |
Fig.2 Pinakamainam na pH
Fig.3 Pinakamainam na temperatura
Fig.4 pH Stability
Fig.5 Thermal stability
Fig.6 Katatagan ng imbakan sa 25 ℃
