M-MLV Reverse Transcriptase
Ang RevScript Reverse transcriptase ay nakuha sa pamamagitan ng teknolohiyang genetic engineering.Ito ay may mas mataas na cDNA synthesis na kakayahan, thermal stability at reaction temperature limit (hanggang 60°C).Ang synthesized na produkto ng cDNA ay hanggang 10 kb.Pinahuhusay nito ang pagkakaugnay ng mga template at angkop para sa reverse transcription ng mga template ng RNA na may kumplikadong pangalawang istraktura o mababang kopya ng mga gene.
Mga bahagi
| Component | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200,000U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 mL |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μL | 1.25 ML | 5 mL |
Kondisyon ng Imbakan
Ang produktong ito ay dapat na nakaimbak sa -25°C~-15°C sa loob ng 2 taon.
Kahulugan ng Yunit
Isinasama ng isang unit ang 1 nmol ng dTTP sa acid-insoluble na materyal sa loob ng 10 minuto sa 37°C gamit ang Oligo(dT) bilang mga primer.
Setup ng Reaksyon
1.Denaturasyon ng RNA template (Ang hakbang na ito ay opsyonal, ang denaturation ng RNA template ay nakakatulong upang buksan ang pangalawang istruktura, na magpapahusay sa ani ng unang strand cDNA.)
| Mga bahagi | Dami (μL) |
| RNase libreng ddH2O | Hanggang 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) o Random na Primer (50 μmol/L) O Gene Specific Primer (2 μmol/L) | 1 |
| o 1 | |
| o 1 | |
| RNA template | X a |
Mga Tala:
1) a: Kabuuang RNA: 1-5 ug o mRNA: 1-500 ng
2) I-incubating sa 65°C sa loob ng 5 minuto, pagkatapos ay ilipat kaagad sa yelo upang palamigin ng 2 minuto.Maikling sentripugasyon upang mangolekta ng reaksyong likido, idagdag ang reverse transcription reaction solution tulad ng ipinapakita sa sumusunod na talahanayan.Dahan-dahang mag-pipette para ihalo.
1.Paghahanda ng pinaghalong reaksyon (20 μL volume)
| Mga bahagi | Dami (μL) |
| Pinaghalo ng nakaraang hakbang | 13 |
| 5×Buffer | 4 |
| dNTP Mix (10nmol/L) | 1 |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 |
1.Gawin ang reaksyon sa ilalim ng mga sumusunod na kondisyon:
| Temperatura (°C) | Oras |
| 25 °Ca | 5mins |
| 42 °Cb | 15-30mins |
| 85 °Cc | 5mins |
Mga Tala:
1) a.Ang pag-incubate sa 25°C sa loob ng 5mins ay kinakailangan lamang para sa paggamit ng mga random na hexamer.Pakilaktawan ang hakbang na ito kapag gumagamit ng Oligo (dT)18o Gene Specific Primer.
2) b.Ang inirerekumendang reverse transcription na temperatura ay 42°C, Para sa mga template na may kumplikadong pangalawang istruktura o mataas na GC na nilalaman, inirerekomendang itaas ang temperatura ng reaksyon sa 50-55°C.
3) c.Pag-init sa 85°C sa loob ng 5mins para ma-inactivate ang reverse transcriptase.
4) Maaaring direktang gamitin ang produkto sa mga reaksyon ng PCR o qPCR, o iimbak sa -20°C para sa panandaliang imbakan.Inirerekomenda na ihalo ang mga produkto at iimbak sa -80°C para sa pangmatagalang imbakan.Iwasan ang madalas na freeze-thaw.
5) Ang produkto ay angkop para sa isang hakbang na RT-qPCR, inirerekumenda na magdagdag ng 10-20 U reverse transcriptase para sa bawat 25μL na sistema ng reaksyon, o unti-unting taasan ang dami ng reverse transcriptase ayon sa aktwal na sitwasyon.
Mga Tala
1.Mangyaring panatilihing malinis ang pang-eksperimentong lugar;Ang mga malinis na guwantes at maskara ay dapat magsuot sa panahon ng operasyon.Ang lahat ng mga consumable na ginamit sa eksperimento ay dapat na walang RNase upang maiwasan ang kontaminasyon ng RNase.
2.Ang lahat ng mga pamamaraan ay dapat gawin sa yelo upang maiwasan ang pagkasira ng RNA.
3.Ang mataas na kalidad na mga sample ng RNA ay inirerekomenda upang matiyak ang mataas na kahusayan ng reverse transcription.
4.Ang produktong ito ay para lamang sa paggamit ng pananaliksik.
5.Mangyaring magpatakbo gamit ang mga lab coat at disposable gloves, para sa iyong kaligtasan.
