Vaccinia Virus Capping Enzyme

Ang Vaccinia virus capping enzyme ay nagmula sa isang recombinant na E. coli strain na nagdadala ng mga gene para sa Vaccinia capping enzyme.Ang nag-iisang enzyme na ito ay binubuo ng dalawang subunits (D1 at D12) at may tatlong aktibidad na enzymatic (RNA triphosphatase at guanylyltransferase ng D1 subunit at guanine methyltransferase ng D12 subunit).Ang Vaccinia virus Capping Enzyme ay epektibo upang ma-catalyze ang pagbuo ng cap structure, na maaaring partikular na ikabit ang 7-methylguanylate cap structure (m7Gppp, Cap 0) sa 5′ end ng RNA.Ang istraktura ng cap (Cap 0) ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa pagpapapanatag, transportasyon at pagsasalin ng mRNA sa mga eukaryotes.Ang capping RNA sa pamamagitan ng enzymatic reaction ay isang epektibo at simpleng paraan na maaaring makabuluhang mapabuti ang katatagan at pagsasalin ng RNA para sa in vitro transcription, transfection, at microinjection.

Mga bahagi

Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)

10×Capping Buffer

Mga kondisyon ng imbakan

-25～- 15℃ para sa imbakan （ Iwasan ang paulit-ulit na freeze-thaw cycle）

Buffer ng imbakan

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol.

Kahulugan ng Yunit

Ang isang yunit ng Vaccinia virus Capping Enzyme ay tinukoy bilang ang dami ng enzyme na kinakailangan upang maisama ang 10pmol ng GTP sa isang 80nt transcript sa loob ng 1 oras sa 37°C.

Kontrol sa Kalidad

Exonuclease:10U ng Vaccinia virus Capping Enzyme na may 1μg λ-Hind III digest DNA sa 37 ℃ sa loob ng 16 na oras ay hindi magbubunga ng degradasyon gaya ng tinutukoy ng agarose gel electrophoresis.

Endonuclease:10U ng Vaccinia virus Capping Enzyme na may 1μg λDNA sa 37 ℃ sa loob ng 16 na oras ay hindi nagbubunga ng degradasyon gaya ng tinutukoy ng agarose gel electrophoresis.

Nickase:10U ng Vaccinia virus Capping Enzyme na may 1 μg pBR322 sa 37 ℃ sa loob ng 16 na oras ay hindi magbubunga ng degradasyon gaya ng tinutukoy ng agarose gel electrophoresis.

RNase:10U ng Vaccinia virus Capping Enzyme na may 1.6μg MS2 RNA sa loob ng 4 na oras sa 37 ℃ ay hindi magbubunga ng degradasyon gaya ng tinutukoy ng agarose gel electrophoresis.

1.coli DNA:Ang 10U ng Vaccinia virus Capping Enzyme ay na-screen para sa pagkakaroon ng E. coli genomic DNA gamit ang TaqMan qPCR na may mga panimulang aklat na partikular para sa E. coli 16S rRNA locus.Ang E. coli genomic DNA contamination ay≤1 E. coli genome.

2.Bakterya Endotoxin: LAL-test, ayon sa Chinese Pharmacopoeia IV 2020 edition, gel limit test method, pangkalahatang tuntunin (1143).Ang nilalaman ng bacterial endotoxin ay dapat na ≤10 EU/mg.

Sistema ng reaksyon at kundisyon

1. Capping Protocol (volume ng reaksyon: 20 μL)

Ang pamamaraang ito ay naaangkop sa capping reaction ng 10μg RNA (≥100 nt) at maaari itong palakihin ayon sa mga pang-eksperimentong pangangailangan.

I) Pagsamahin ang 10μg RNA at Nuclease-free H2O sa isang 1.5 ml microfuge tube sa huling volume na 15.0 μL.*10×Capping Buffer: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)

2) Painitin sa 65 ℃ sa loob ng 5 minuto na sinusundan ng ice bath sa loob ng 5 minuto.

3) Idagdag ang mga sumusunod na bahagi sa pagkakasunud-sunod na tinukoy

*10×Capping Buffer：0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) I-incubate sa 37°C sa loob ng 30 minuto, ang RNA ay nalimitahan na ngayon at handa na para sa mga aplikasyon sa ibaba ng agos.

2. 5′ terminal reaksyon ng label (dami ng reaksyon: 20 μL)

Ang protocol na ito ay idinisenyo upang lagyan ng label ang RNA na naglalaman ng 5' triphosphate at maaari itong palakihin ayon sa mga hinihingi.Ang kahusayan ng pagsasama ng label ay maaapektuhan ng molar ratio ng RNA: GTP, pati na rin ang nilalaman ng GTP sa mga sample ng RNA.

1) Pagsamahin ang naaangkop na dami ng RNA at Nuclease-free H2O sa isang 1.5 ml microfuge tube hanggang sa huling volume na 14.0 µL.

2) Painitin sa 65 ℃ sa loob ng 5 minuto na sinusundan ng ice bath sa loob ng 5 minuto.

3) Idagdag ang mga sumusunod na sangkap sa pagkakasunud-sunod na tinukoy.

** Ang GTP MIX ay tumutukoy sa GTP at isang maliit na bilang ng mga marker.Para sa konsentrasyon ng GTP, sumanggunisa Tala 3.

4) I-incubate sa 37°C sa loob ng 30 minuto, ang dulo ng RNA 5′ ay may label na ngayon at handa na para sa ibaba ng agos

Mga aplikasyon

1. Pag-capping ng mRNA bago ang mga pagsusuri sa pagsasalin/in vitro na pagsasalin

2. Paglalagay ng label sa 5' dulo ng mRNA

Mga tala sa paggamit

1.Ang pag-init ng solusyon ng RNA bago ang pagpapapisa ng itlog gamit ang Vaccinia Capping Enzyme ay nag-aalis ng pangalawang istraktura sa 5'end ng transcript.Palawigin ang oras hanggang 60 minuto para sa mga transcript na may kilalang 5´ends na may mataas na istraktura.

2. Ang RNA na ginagamit para sa mga reaksyon ng capping ay dapat na dalisayin bago gamitin at sinuspinde sa tubig na walang nuclease.Ang EDTA ay hindi dapat naroroon at ang solusyon ay dapat na walang mga asin.

3. Para sa paglalagay ng label sa dulong 5', ang kabuuang konsentrasyon ng GTP ay dapat nasa paligid ng 1-3 beses ng molar na konsentrasyon ng mRNA sa reaksyon.

4. Ang dami ng sistema ng reaksyon ay maaaring palakihin o pababain ayon sa aktwal.