PNGase F
Ang Peptide-N-Glycosidase F(PNGase F) ay ang pinakaepektibong paraan ng enzymatic para sa pag-alis ng halos lahat ng N-linked oligosaccharides mula sa glycoproteins.Ang PNGase F ay isang amidase, na humihiwalay sa pagitan ng pinakaloob na GlcNAc at asparagine residues ng high mannose, hybrid, at complex oligosaccharides mula sa N-linked glycoproteins.
Aplikasyon
Ang enzyme na ito ay kapaki-pakinabang para sa pag-alis ng mga residue ng carbohydrate mula sa mga protina.
Paghahanda at pagtutukoy
| Hitsura | Walang kulay na likido |
| Kadalisayan ng protina | ≥95% (mula sa SDS-PAGE) |
| Aktibidad | ≥500,000 U/mL |
| Exoglycosidase | Walang aktibidad na matukoy (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| Protease | ND |
Ari-arian
| Numero ng EC | 3.5.1.52(Recombinant mula sa microorganism) |
| Molekular na timbang | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektrikong punto | 8. 14 |
| Pinakamainam na pH | 7.0-8.0 |
| Pinakamainam na temperatura | 65 °C |
| Pagtitiyak ng substrate | Pag-alis ng mga glycosidic bond sa pagitan ng GlcNAc at asparagine residues Fig.1 |
| Mga site ng pagkilala | N-linked glycans maliban kung naglalaman ng α1-3 fucose Fig. 2 |
| Mga activator | DTT |
| Inhibitor | SDS |
| Temperatura ng imbakan | -25 ~-15 ℃ |
| Hindi Aktibidad ng init | Ang isang 20µL reaction mixture na naglalaman ng 1µL ng PNGase F ay inactivated sa pamamagitan ng incubation sa 75 °C sa loob ng 10 minuto. |
Fig. 1 Pagtitiyak ng substrate ng PNGase F
Fig. 2 Recognition sits ng PNGase F.
Kapag ang panloob na mga residue ng GlcNAc ay naka-link sa α1-3 fucose, hindi maaaring alisin ng PNGase F ang N-linked na oligosaccharides mula sa glycoproteins.Ang pagbabagong ito ay karaniwan sa mga halaman at ilang mga glycoprotein ng insekto.
Cmga kalaban
|
| Mga bahagi | Konsentrasyon |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×Glycoprotein Denaturing Buffer | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Depinisyon ng yunit
Ang isang unit(U) ay tinukoy bilang ang dami ng enzyme na kinakailangan upang alisin ang >95% ng carbohydrate mula sa 10 µg ng denatured RNase B sa loob ng 1 oras sa 37°C sa kabuuang dami ng reaksyon na 10 µL.
Mga kondisyon ng reaksyon
1. I-dissolve ang 1-20 µg ng glycoprotein na may deionized na tubig, magdagdag ng 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer at H2O (kung kinakailangan) upang makagawa ng 10 µl kabuuang dami ng reaksyon.
2.I-incubate sa 100°C sa loob ng 10 min, palamig ito sa yelo.
3.Magdagdag ng 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 at paghaluin.
4.Magdagdag ng 1-2 µl PNGase F at H2O (kung kinakailangan) upang makagawa ng 20 µl kabuuang dami ng reaksyon at paghaluin.
5.I-incubate ang reaksyon sa 37°C sa loob ng 60 min.
6.Para sa pagsusuri ng SDS-PAGE o pagsusuri sa HPLC.
