mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

Ang mRNA Cap 2' -O-methyltransferase ay nagmula sa isang recombinant E. coli strain na nagdadala ng gene para sa vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase.Ang enzyme na ito ay nagdaragdag ng methyl group sa 2'-O na posisyon ng unang nucleotide na katabi ng cap structure sa 5'end ng RNA. Ginagamit ng enzyme ang S-adenosylmethionine (SAM) bilang isang methyl donor para sa methylate na may takip na RNA (cap -0) na nagreresulta sa isang cap- 1 na istraktura.

Maaaring pataasin ng istruktura ng Cap1 ang kahusayan sa pagsasalin, pagpapabuti ng pagpapahayag ng mRNA sa mga eksperimento sa paglilipat at microinjection. Partikular na nangangailangan ang enzyme na ito ng RNA na may takip ng m7GpppN bilang substrate.Hindi nito magagamit ang RNA na may pN, ppN, pppN o GpppN sa dulo ng 5'.Ang capped RNA ay maaaring ihanda sa pamamagitan ng in vitro transcription gamit ang cap analog o sa pamamagitan ng enzymatic capping gamit ang Vaccinia Capping Enzyme.

Mga bahagi

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10×Capping Reaction Buffer

Imbakan

-25 ～- 15 ℃ para sa imbakan （ Iwasan ang paulit-ulit na freeze-thaw cycles）

Buffer ng imbakan

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100， 50% glycerol.

Depinisyon ng yunit

Ang isang yunit ay tinukoy bilang ang dami ng enzyme na kinakailangan upang mag-methylate ng 10 pmoles ng 80 nt na nakatakip na RNA transcript sa loob ng 1 oras sa 37°C.

Mga pagsusuri sa kontrol ng kalidad

Exonuclease:50U ng mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase na may 1μg λ-Hind III digest DNA sa 37 ℃ sa loob ng 16 na oras ay hindi nagbubunga ng degradasyon gaya ng tinutukoy ng agarose gel electrophoresis.

Endonuclease: 50 U ng mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase na may 1 μg λDNA sa 37 ℃ sa loob ng 16 na oras ay hindi nagbubunga ng degradasyon gaya ng tinutukoy ng agarose gel electrophoresis.

Nickase: 50U ng mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase na may 1μg pBR322 sa 37 ℃ sa loob ng 16 na oras ay hindi nagbubunga ng degradasyon gaya ng tinutukoy ng agarose gel electrophoresis.

RNase: 50U ng mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase na may 1.6μg MS2 RNA sa loob ng 4 na oras sa 37 ℃ ay hindi nagbubunga ng degradasyon gaya ng tinutukoy ng agarose gel electrophoresis.

E. coli DNA: 50U ng mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ay na-screen para sa pagkakaroon ngE. coli genomic DNA gamit ang TaqMan qPCR na may mga panimulang aklat na tiyak para saE. coli 16S rRNA locus.AngE. coli genomic DNA contamination ay =1E. coli genome.

Bakterya Endotoxin: LAL-test, ayon sa Chinese Pharmacopoeia IV 2020 edition, gel limit test method, general rule (1143).Ang nilalaman ng bacterial endotoxin ay dapat na =10 EU/mg.

Sistema ng reaksyon at kundisyon

1. Pagsamahin ang naaangkop na dami ng Capped RNA at RNase-free H2O sa isang 1.5 mL microfuge tube hanggang sa huling volume na 16.0 µL.

2. Painitin sa 65 ℃ sa loob ng 5 minuto na sinusundan ng isang ice-bath sa loob ng 5 minuto.

3. Idagdag ang mga sumusunod na bahagi sa pagkakasunud-sunod na tinukoy (para sa methylation ng Capped RNA

mas mababa sa 10

*10× Capping Reaction Buffer : 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. I-incubate sa 37 ℃ sa loob ng 1 oras (2 oras ng incubation ay inirerekomenda para sa target na fragment na mas mababa sa 200 nt).

Mga aplikasyon

Upang mapabuti ang pagpapahayag ng mRNA sa panahon ng mga eksperimento sa microinjection at paglipat.

Mga tala sa paggamit

1. Bago ang reaksyon, ang RNA ay dapat na purified at dissolved sa nuclease-free na tubig, ang lahat ng mga solusyon ay hindi dapat maglaman ng anumang EDTA at ions.

2. Inirerekomenda na painitin ang sample na RNA sa 65 ℃ para sa 5 min bago ang reaksyon upang alisin ang pangalawang istraktura sa 5'end ng transcript.Maaari itong palawigin sa 10 min para sa kumplikadong 5 ´ -terminal na istraktura.