Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA KIT

Ang kit na ito ay isang Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) coupling sa biotin-Streptavidin system, para sa quantitative measurement ng dsRNA na may haba na higit sa 60 base pairs(bp), anuman ang sequence.Ang plato ay pre-coated na may anti-dsRNA antibody.Ang dsRNA na naroroon sa sample ay idinagdag at nagbubuklod sa mga antibodies na pinahiran sa mga balon.At pagkatapos ay idinagdag ang biotinylated anti-dsRNA antibody at nagbubuklod sa dsRNA sa sample.Pagkatapos ng paghuhugas, ang HRP-Streptavidin ay idinagdag at nagbubuklod sa Biotinylated anti-dsRNA antibody.Pagkatapos ng incubation unbound HRP-Streptavidin ay hugasan.Pagkatapos ay ang TMB substrate solution ay idinagdag at na-catalyze ng HRP upang makabuo ng asul na kulay na produkto na naging dilaw pagkatapos magdagdag ng acidic stop solution.Ang density ng dilaw ay proporsyonal sa target na halaga ng dsRNA na nakuha sa plato.Ang pagsipsip ay sinusukat sa 450 nm.

Aplikasyon

Ang kit na ito ay para sa quantitative measurement ng natitirang dsRNA.

Mga bahagi ng kit

Imbakan at Katatagan

1. Para sa hindi nagamit na kit: Ang buong kit ay maaaring maimbak sa 2~8 ℃ sa shelf life.Dapat na iwasan ang malakas na liwanag para sa katatagan ng imbakan.

2. Para sa ginamit na kit: Kapag nabuksan na ang microplate, pakitakpan ang mga hindi nagamit na balon ng plate sealer at ibalik sa foil pouch na naglalaman ng desiccant pack, i-zip-seal ang foil pouch at bumalik sa 2~8 ℃ sa lalong madaling panahon pagkatapos gamitin.Ang iba pang mga reagents ay dapat ibalik sa 2~8 ℃ sa lalong madaling panahon pagkatapos gamitin.

Mga Materyales na Kinakailangan Ngunit Hindi Ibinibigay

1. Microplate reader na may 450±10nm na filter (mas maganda kung makaka-detect sa 450 at 650 nm wavelength).

2. Microplate shaker.

3. RNase-free na mga tip at centrifuge tubes.

Flowchart ng Operasyon

Bago ka magsimula

1. Dalhin ang lahat ng sangkap at sample ng kit sa temperatura ng silid (18-25 ℃) bago gamitin.Kung ang kit ay hindi mauubos sa isang pagkakataon, mangyaring kumuha lamang ng mga strip at reagents para sa kasalukuyang eksperimento, at iwanan ang natitirang mga strip at reagents sa kinakailangang kondisyon.

2. Wash buffer: dilute ang 40mL ng 20× concentrated wash buffer na may 760mL ng deionized o distilled water upang maghanda ng 800mL ng 1× wash buffer.

3. Pamantayan: saglit na paikutin o i-centrifuge ang stock solution bago gamitin.Ang konsentrasyon ng apat na pamantayang ibinigay ay 5ng/μL.Para sa mga pamantayan ng UTP at pUTP dsRNA, paki-dilute ang stock solution sa 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL gamit ang STE buffer para iguhit ang karaniwang curve.Para sa mga pamantayan ng N1-Me-pUTP dsRNA, paki-dilute ang stock solution sa 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL na may STE buffer para iguhit ang karaniwang curve.Para sa 5-OMe-UTP dsRNA standard, paki-dilute ang stock solution sa 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL na may STE buffer para iguhit ang standard curve.Inirerekomenda namin na ang mga pamantayan ay maaaring matunaw bilang mga sumusunod na tsart:

4. Biotinylated detection antibody at HRP-streptavidin working solution: saglit na paikutin o centrifuge ang stock solution bago gamitin.Dilute ang mga ito sa gumaganang konsentrasyon na may dilution buffer.

5. TMB substate: aspirate ang kinakailangang dosis ng solusyon gamit ang mga sterilized na tip at huwag itapon muli ang natitirang solusyon sa vial.Ang TMB substate ay sensitibo sa liwanag, huwag ilantad ang TMB substrate sa liwanag nang mahabang panahon.

Gamit ang protocol

1. Tukuyin ang bilang ng mga strip na kinakailangan para sa assay.Ipasok ang mga piraso sa mga frame para magamit.Ang mga natitirang plate strip na hindi ginamit sa assay na ito ay dapat na i-repack sa bag na may desiccant.Isara nang mahigpit ang bag para sa palamigan na imbakan.

2. Magdagdag ng 100μL bawat isa sa mga dilution ng standard, blangko at mga sample sa naaangkop na mga balon.Takpan gamit ang plate sealer.I-incubate nang 1 oras sa temperatura ng kuwarto na may pag-alog sa 500rpm.Ang mga sample ay dapat na diluted na may STE buffer sa naaangkop na konsentrasyon para sa tumpak na assay.

3. Hakbang sa paghuhugas: I-aspirate ang solusyon at hugasan gamit ang 250μL wash buffer sa bawat balon at hayaan itong tumayo ng 30s.Itapon nang buo ang wash buffer sa pamamagitan ng pag-snap ng plato sa sumisipsip na papel.Ganap na hugasan ng 4 na beses.

4. Magdagdag ng 100μL ng biotinylated detection antibody working solution sa bawat balon.Takpan gamit ang plate sealer.I-incubate nang 1 oras sa temperatura ng kuwarto na may pag-alog sa 500rpm.

5. Ulitin ang hakbang sa paghuhugas.

6. Magdagdag ng 100μL ng HRP-streptavidin working solution sa bawat balon.Takpan gamit ang plate sealer.I-incubate ng 30min sa room temperature na may pag-alog sa 500rpm.

7. Ulitin muli ang hakbang sa paghuhugas.

8. Magdagdag ng 100μL ng TMB substrate solution sa bawat balon.Takpan gamit ang plate sealer.I-incubate ng 30 min sa RT Protect mula sa liwanag.Ang likido ay magiging asul sa pamamagitan ng pagdaragdag ng substrate solution.

9. Magdagdag ng 50μL ng stop solution sa bawat balon.Ang likido ay magiging dilaw sa pamamagitan ng pagdaragdag ng stop solution.Pagkatapos ay patakbuhin ang microplate reader at magsagawa ng pagsukat sa 450nm kaagad.

Pagkalkula ng mga Resulta

1. I-average ang mga duplicate na pagbabasa para sa bawat pamantayan, kontrol, at mga sample at ibawas ang average na zero standard na optical density.Bumuo ng isang karaniwang curve na may absorbance sa vertical(Y) axis at dsRNA concentration sa horizontal(X）axis.

2. Inirerekomenda na gawin ang pagkalkula gamit ang computer-based na curve-fitting software tulad ng curve expert 1.3 o ELISA Calc sa isang 5 o 4 na parameter na hindi linear fit na modelo.

Pagganap

1. Sensitibo:

mababang limitasyon ng pagtukoy: ≤ 0.001pg/μL (para sa UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (para sa 5-OMe-UTP-dsRNA).

mas mababang limitasyon ng quantitation:0.0156 pg/μL (para sa UTP-, pUTP-dsRNA),0.0312 pg/μL (para sa N1-Me-pUTP-dsRNA),0.0625 pg/μL (para sa 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Katumpakan: CV ng Intra-Assay ≤10%, CV ng Inter-Assay ≤10%

3. Pagbawi: 80%~120%

4.Linearity:0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(para sa 5-OMe-UTP-dsRNA).

Mga pagsasaalang-alang

1. Ang temperatura at oras ng reaksyon ng TMB ay kritikal, mangyaring kontrolin ang mga ito ayon sa mahigpit na tagubilin.

2. Upang makamit ang mahusay na reproducibility at sensitivity ng assay, ang wastong paghuhugas ng mga plato upang maalis ang labis na hindi na-react na mga reagent ay mahalaga.

3. Ang lahat ng mga reagents ay dapat ihalo nang lubusan bago gamitin at maiwasan ang mga bumble sa panahon ng sample o pagdaragdag ng mga reagents.

4. Kung ang mga kristal ay nabuo sa puro wash buffer(20x), magpainit hanggang 37 ℃ at ihalo nang malumanay hanggang sa ganap na matunaw ang mga kristal.

5. Iwasan ang pagsusuri ng mga sample na naglalaman ng Sodium Azide (NaN3), dahil maaari nitong sirain ang aktibidad ng HRP na magreresulta sa under-estimation ng dami ng dsRNA.

6. Iwasan ang kontaminasyon ng RNase sa panahon ng pagsusuri.

7. Ang standard/sample, detection antibody at SA-HRP ay maaari ding isagawa sa RT nang hindi nanginginig, ngunit maaari itong magdulot ng pagbaba ng sensitivity ng detection ng isang beses.Para sa kasong ito, inirerekomenda namin na ang mga pamantayan ng UTP at pUTP dsRNA ay dapat na diluted mula sa 2pg/μL, ang mga pamantayan ng N1-Me-pUTP dsRNA ay dapat na diluted mula sa 4pg/μL at ang 5-OMe-UTP dsRNA na pamantayan ay dapat na diluted mula sa 8pg/μL.Bilang karagdagan, i-incubate ang HRP-streptavidin working solution sa loob ng 60min sa temperatura ng kuwarto.Huwag gumamit ng flask shaker, dahil ang flask shaker ay maaaring magresulta sa hindi tumpak na resulta.

Karaniwang resulta

1. Standard curve data

2. Karaniwang pagkalkula ng curve

3. Saklaw ng pagtuklas ng Liner:0.0312- 1pg/μL